轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究（RNA-seq）

轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究包括mRNA、lncRNA、circRNA、小RNA測序，差異分析。

LongRNA-seq是一種全面檢測細(xì)胞和組織長片段RNA（200nt） 的轉(zhuǎn)錄組測序方法，包括線性的mRNA和lncRNA分子，以及環(huán)狀RNA，可準(zhǔn)確高效揭示轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)全貌，是非編碼RNA的重要研究技術(shù)。

lncRNA是一類長度大于200nt，無典型開放閱讀框(ORF)的RNA，其數(shù)量遠(yuǎn)高于編碼蛋白質(zhì)的mRNA。它們的基因背景很豐富，可以是由啟動子、增強(qiáng)子起始的序列，基因內(nèi)含子，RNA的反義鏈，亦或是基因之間的序列等。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA可在表觀遺傳學(xué)水平(包括DNA 甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重構(gòu))、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，從而參與各種基本生命活動和疾病的發(fā)生發(fā)展過程。

與傳統(tǒng)的線性RNA（linear RNA，含5’和3’末端）不同，circRNA分子呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不受RNA外切酶影響，表達(dá)更穩(wěn)定，不易降解。在功能上，近年的研究表明，circRNA分子富含miRNA結(jié)合位點(diǎn)，在細(xì)胞中起到miRNA海綿（ miRNA sponge）的作用，進(jìn)而解除miRNA對其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表達(dá)水平；這一作用機(jī)制被稱為競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）機(jī)制。通過與疾病關(guān)聯(lián)的miRNA相互作用， circRNA在疾病中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。而最新的研究發(fā)現(xiàn)，還存在大量的環(huán)形RNA可作為信使RNA來編碼蛋白，這些環(huán)形信使RNA通過一種常見的RNA甲基化修飾m6A，來驅(qū)動非帽依賴性的翻譯機(jī)制來合成蛋白質(zhì)。

RNA m6A檢測

真核基因通常產(chǎn)生多種RNA異構(gòu)體（isoform），可以產(chǎn)生功能上不同的蛋白質(zhì)變體。傳統(tǒng)二代測序?qū)嶋H上是一種短讀長RNA-seq，難以獲得完整的轉(zhuǎn)錄本，無法體現(xiàn)異構(gòu)體的多樣性。

基于Oxford Nanopore公司的納米孔測序平臺，直接對RNA進(jìn)行測序，具有長讀長的優(yōu)勢，提高對異構(gòu)體的檢測，還能直接檢測m6A、m5C等核酸修飾，在可變剪切研究方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢。一次測序，即可滿足多項表觀遺傳轉(zhuǎn)錄組研究需求，大大提升研究的高度、深度、準(zhǔn)確性、效率，尤其適用于多組學(xué)分子機(jī)制及珍貴的臨床樣本研究。

ONT優(yōu)勢：
1. 作為長讀長測序技術(shù)，能減少短讀長測序打斷后重新拼接帶來的歧義，結(jié)果準(zhǔn)確度更高、更可信；
2. 能夠直接對RNA進(jìn)行測序，避免逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增導(dǎo)致的RNA修飾信息缺失；
3. 可以直接檢測m6A等堿基修飾，配合優(yōu)化的算法，獲得無損的m6A單堿基分辨率圖譜；
4. 一次測序，多套數(shù)據(jù)：轉(zhuǎn)錄組圖譜、m6A修飾圖譜、異構(gòu)體、可變剪切情況，節(jié)省珍貴的臨床樣本，節(jié)省樣本準(zhǔn)備時間和精力，且保持了樣本的統(tǒng)一性。

蛋白質(zhì)組學(xué)

iTRAQ和TMT是分別由美國AB Sciex公司和Thermo公司研發(fā)的多肽體外標(biāo)記定量技術(shù)，采用8種或10種同位素標(biāo)簽,通過特異性標(biāo)記多肽的氨基酸基團(tuán)同，一次上機(jī)可實(shí)現(xiàn)8種或10種不同樣本中蛋白質(zhì)的相對定量,是近年來定量蛋白質(zhì)組學(xué)常用的高通量篩選技術(shù)。

iTRAQ和TMT原理類似，以iTRAQ試劑為例，該試劑結(jié)構(gòu)由報告基團(tuán)、中性平衡基團(tuán)和反應(yīng)基團(tuán)三部分組成。不同報告基團(tuán)及其相對應(yīng)平衡基團(tuán)的質(zhì)量和都相同，而反應(yīng)基團(tuán)能與賴氨酸ε氨基和所有肽鏈的氨基末端連接，可標(biāo)記所有氨基酸。
不同標(biāo)記試劑與來源于不同樣品胰酶消化后的肽段結(jié)合，,經(jīng)過色譜分離，并通過一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜。平衡基團(tuán)在二級質(zhì)譜時發(fā)生中性丟失，而報告基團(tuán)在二級質(zhì)譜低質(zhì)量區(qū)域產(chǎn)生多個報告離子，其信號強(qiáng)度分別代表該標(biāo)記樣品的表達(dá)量，根據(jù)報告離子的峰面積計算同一蛋白質(zhì)同一肽段在不同樣品間的比值,從而實(shí)現(xiàn)蛋白的相對定量。