這涉及通過(guò)測(cè)量關(guān)鍵生物標(biāo)志物/抗原的存在與否以及細(xì)胞的FSC及SSC特性來(lái)分析白細(xì)胞。

免疫表型分析的可靠性取決于幾個(gè)因素，包括樣品的質(zhì)量以及染色和處理試劑、儀器性能以及分析的質(zhì)量。

表1. 用于免疫表型應(yīng)用的基本標(biāo)記。 流式細(xì)胞術(shù)現(xiàn)在是用于譜系評(píng)估、惡性腫瘤成熟表征、異質(zhì)性和亞群定量的首選方法。??

定量PCR(Quantitative PCR, qPCR)，也稱(chēng)實(shí)時(shí)PCR(Real-time PCR)或者實(shí)時(shí)定量PCR，是指借助熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針，在PCR指數(shù)擴(kuò)增期間實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)體系中的熒光信號(hào)強(qiáng)度的變化，從而對(duì)目的基因進(jìn)行定量分析的PCR檢測(cè)技術(shù)。

基因表達(dá)的研究一般采用相對(duì)定量的方法。相對(duì)定量法必須對(duì)樣品的目的基因和內(nèi)參基因同時(shí)分別進(jìn)行定量，然后 得出對(duì)于內(nèi)參基因的目的基因的相對(duì)量。通過(guò)比較樣品中目的基因反轉(zhuǎn)錄之后的 DNA 量來(lái)研究不同樣品間的 mRNA 表達(dá)量情況。內(nèi)參基因通常選用 β-actin 或 GAPDH。通過(guò)同時(shí)對(duì)內(nèi)參基因的實(shí)時(shí)檢測(cè)，可以對(duì)樣品之間由于起始細(xì) 胞數(shù)不同或 RNA 提取效率不同等造成的 RNA 量誤差進(jìn)行校正，達(dá)到在嚴(yán)格意義上對(duì)樣品之間的 mRNA 表達(dá)量進(jìn)行分析的目的。

雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)

雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)系統(tǒng)采用熒火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶組成雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)中，報(bào)告基因（熒火蟲(chóng)熒光素酶）活力的改變，與基因表達(dá)的特定實(shí)驗(yàn)條件相關(guān)；而示蹤基因（海腎熒光素酶）作為內(nèi)對(duì)照，使測(cè)試不被實(shí)驗(yàn)條件變化所干擾，減少內(nèi)在的變化因素所削弱的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，如，培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目和活力的差別，細(xì)胞轉(zhuǎn)染和裂解的效率等。熒火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶測(cè)試的組合，提供了雙遺傳報(bào)告基因應(yīng)用的理想測(cè)試系統(tǒng)。

使用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)可檢測(cè)miRNA與預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的相互作用或轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的相互作用。

然而，流式細(xì)胞儀，不容易熟練掌握，需要在設(shè)備和技術(shù)培訓(xùn)方面進(jìn)行大量投資。

因此，對(duì)于許多研究人員而言，將流式細(xì)胞儀外包給合同研究組織 (CRO) 既具有成本效益，又是確保從他們的樣本中獲得最高質(zhì)量數(shù)據(jù)的最佳方式。

服務(wù)項(xiàng)目

a) 免疫表型 Immunophenotyping；

b) 細(xì)胞分型 Cell Sorting；

c) 受體占用 Receptor Occupancy；

d) 細(xì)胞功能檢測(cè)（凋亡、周期、ROS、線(xiàn)粒體膜電位）Functional Cellular Assays；

e) 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色I(xiàn)ntracellular Cytokine staining；

f)T細(xì)胞活化/耗竭檢測(cè) T Cell Activation/Exhaustion Assays

Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離的蛋白質(zhì)樣品，通過(guò)轉(zhuǎn)膜方式轉(zhuǎn)移到固相載體(如PVDF、NC膜)上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶標(biāo)記(通常是HRP)的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物化學(xué)發(fā)光試劑(如ECL)發(fā)光以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。

ELISA( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定

ELISA 是一種結(jié)合抗原、抗體特異性反應(yīng)和酶對(duì)底物高效催化作用的高敏感性免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。ELISA 的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本(測(cè)定其中的抗體或抗原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)，洗滌使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開(kāi)，再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，通過(guò)反應(yīng)使其結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶含量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。

細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期等是腫瘤研究的重要表型，是分子生物學(xué)和藥理學(xué)研究解決的問(wèn)題之一。通過(guò)在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)或干擾某個(gè)基因研究基因?qū)?xì)胞增殖能力的影響，進(jìn)一步研究基因的功能，或?qū)?xì)胞進(jìn)行藥物處理，研究藥物對(duì)增殖的影響。

實(shí)驗(yàn)原理(CCK-8)

細(xì)胞增殖是生物體的重要生命特征，細(xì)胞以分裂的方式進(jìn)行增殖，是生物體生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖和遺傳的基礎(chǔ)。細(xì)胞增殖的研究方法有很多，主要包括：CCK8方法。

Cell Counting Kit-8（簡(jiǎn)稱(chēng)CCK-8）試劑可用于簡(jiǎn)便而準(zhǔn)確的細(xì)胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazan dye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。

CCK-8方法優(yōu)勢(shì)：
1 操作簡(jiǎn)單，避免細(xì)胞計(jì)數(shù)過(guò)程中人為因素的影響；
2 細(xì)胞用量少，檢測(cè)靈敏度高，穩(wěn)定；
3 可反復(fù)用酶標(biāo)儀讀板，檢測(cè)時(shí)間靈活，不影響細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；
4 CCK-8產(chǎn)生的Formazan是水溶性的，無(wú)需換液，尤其適用于懸浮細(xì)胞，與MTT法相比更方便，更安全。
目的：考察目的基因?qū)?xì)胞的增殖能力產(chǎn)生的影響或藥物對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響
材料：目的細(xì)胞、穩(wěn)轉(zhuǎn)株（空載、目的基因）
步驟：細(xì)胞收集——細(xì)胞鋪板——（藥物處理）——細(xì)胞培養(yǎng)——加入CCK-8處理，酶標(biāo)儀檢測(cè)

細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是腫瘤和發(fā)育研究的重點(diǎn)，同時(shí)也是藥理學(xué)研究的熱點(diǎn)。細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下，遵循自身的程序，自主結(jié)束其生命的過(guò)程。它是一個(gè)主動(dòng)的，高度有序的，基因控制的，一系列酶參與的過(guò)程。細(xì)胞凋亡的過(guò)程大致可分為以下幾個(gè)階段：接受凋亡信號(hào)→凋亡調(diào)控分子間的相互作用→蛋白水解酶的活化（Caspase）→進(jìn)入連續(xù)反應(yīng)過(guò)程。

基本原理

細(xì)胞凋亡檢測(cè)采用Annexin V/PI雙染法檢測(cè)，Annexin V是一種分子量為35~36kD的Ca2+依賴(lài)性磷脂結(jié)合蛋白，能與磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）高親和力特異性結(jié)合。在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。將Annexin V 進(jìn)行熒光素（FITC） 標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin V 作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

7-AAD類(lèi)似于碘化丙啶（propidine iodide，PI）是一種核酸染料，它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，7-AAD能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將Annexin V 與7-AAD 匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。
目的： 通過(guò)慢病毒感染獲得過(guò)表達(dá)某基因的細(xì)胞株，利用Annexin-APC和7-AAD雙染法對(duì)正常細(xì)胞、對(duì)照組細(xì)胞、基因過(guò)表達(dá)組細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)，研究基因?qū)?xì)胞凋亡的影響。
材料：質(zhì)粒與細(xì)胞株
步驟：細(xì)胞準(zhǔn)備——收集細(xì)胞——Annexin和 7-AAD/PI進(jìn)行雙染色——流式上機(jī)檢測(cè)

細(xì)胞侵襲和遷移

在腫瘤發(fā)展過(guò)程中，細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的能力是重要的研究對(duì)象。相關(guān)的信號(hào)通路主要可以分為控制細(xì)胞黏附和控制細(xì)胞骨架。細(xì)胞的遷移與侵襲主要與細(xì)胞骨架和黏附相關(guān)。腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力的改變通常采用Transwell進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞劃痕也是測(cè)定腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)特性的方法，由于無(wú)法區(qū)別正常增殖和遷移細(xì)胞，應(yīng)用有局限性。

Transwell實(shí)驗(yàn)

Transwell小室底層的一張有通透性的膜（一般為聚碳酸酯膜），將其放置于孔板中，小室內(nèi)稱(chēng)上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱(chēng)下室。由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞。應(yīng)用Transwell可研究下層培養(yǎng)液中的成分對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)等的影響

腫瘤遷移實(shí)驗(yàn)：研究腫瘤細(xì)胞的遷移能力或特定情況下腫瘤細(xì)胞的遷移能力。常用8.0、12.0μm膜，上室種腫瘤細(xì)胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，腫瘤細(xì)胞會(huì)向營(yíng)養(yǎng)成分高的下室跑，計(jì)數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞量可反映腫瘤細(xì)胞的遷移能力。

腫瘤侵襲實(shí)驗(yàn)：研究腫瘤細(xì)胞的侵襲能力或特定情況下腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。在聚碳酸酯膜上涂上一層基質(zhì)膠，模仿細(xì)胞外基質(zhì)，上室種腫瘤細(xì)胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，細(xì)胞要把基質(zhì)消化后才可以從上室遷移到下室，計(jì)數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞量測(cè)定細(xì)胞的侵襲能力。
目的： 研究目的基因過(guò)表達(dá)/干擾對(duì)細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響
材料：正常細(xì)胞、對(duì)照慢病毒、過(guò)表達(dá)基因慢病毒
步驟：細(xì)胞復(fù)蘇——Transwell鋪板——細(xì)胞培養(yǎng)及染色——拍照
　　
劃痕實(shí)驗(yàn)原理

腫瘤細(xì)胞在體外仍具有遷移的能力。細(xì)胞劃痕法是測(cè)定了腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)特性的方法之一。其借鑒體外細(xì)胞致傷愈合實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停隗w外培養(yǎng)的單層細(xì)胞上，劃痕致傷，然后比較不同實(shí)驗(yàn)組中腫瘤細(xì)胞遷移的能力。
目的： 使用篩選的穩(wěn)定株（轉(zhuǎn)對(duì)照病毒、過(guò)表達(dá)基因病毒），通過(guò)對(duì)空細(xì)胞、對(duì)照穩(wěn)轉(zhuǎn)、目的基因穩(wěn)轉(zhuǎn)三組細(xì)胞進(jìn)行劃痕寬度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，研究基因?qū)?xì)胞遷移能力的影響。
材料：病毒和細(xì)胞株，目的細(xì)胞來(lái)源于客戶(hù)，穩(wěn)定株和元構(gòu)建
步驟：細(xì)胞鋪板——?jiǎng)澗€(xiàn)——細(xì)胞培養(yǎng)及拍照——統(tǒng)計(jì)分析

細(xì)胞周期檢測(cè)

細(xì)胞周期（cell cycle）是指細(xì)胞從一次分裂完成開(kāi)始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過(guò)程，分為間期與分裂期兩個(gè)階段。細(xì)胞周期反應(yīng)了細(xì)胞增殖速度，單個(gè)細(xì)胞的周期測(cè)定可采用縮時(shí)攝影的方法，但它不能代表細(xì)胞群體的周期，故現(xiàn)多采用其他方法測(cè)群體周期。

原理

細(xì)胞周期各時(shí)相的DNA含量不同，通常正常細(xì)胞的 G0/G1期具有二倍體細(xì)胞的DNA 含量(2N)，而G2/M期具有四倍體細(xì)胞的DNA含量(4N)，而S期的DNA含量介于二倍體和四倍體之間。PI 即碘化丙錠，可以與細(xì)胞內(nèi)DNA 和RNA 結(jié)合，采用RNA酶將RNA消化后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到的與DNA 結(jié)合的PI 的熒光強(qiáng)度直接反映了細(xì)胞內(nèi)DNA含量的多少。

因此，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)PI染色法對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA含量進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，可以將細(xì)胞周期各時(shí)相區(qū)分為 G0/G1期，S 期和G2/M期，并可通過(guò)特殊軟件計(jì)算各時(shí)相的百分率。
目的： 通過(guò)慢病毒感染獲得基因過(guò)表達(dá)的細(xì)胞株，利用PI染色法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞周期的變化。從而研究目的基因?qū)?xì)胞周期的影響。
材料：目的細(xì)胞、病毒
步驟：細(xì)胞準(zhǔn)備——樣品收集——上機(jī)檢測(cè)——數(shù)據(jù)分析

克隆形成實(shí)驗(yàn)

原理

單個(gè)細(xì)胞在體外增殖6代以上（時(shí)間約1周以上），其后代所形成的細(xì)胞群體，稱(chēng)為集落或克隆。每個(gè)克隆含有50個(gè)以上的細(xì)胞，大小在0.3 – 1.0mm之間。細(xì)胞接種存活率只表示接種細(xì)胞后貼壁的細(xì)胞數(shù)， 但貼壁后的細(xì)胞不一定每個(gè)都能增殖并形成克隆。只有同時(shí)具有貼壁和增殖活力的細(xì)胞才會(huì)形成克隆。克隆形成率反映細(xì)胞的獨(dú)立生存能力的強(qiáng)弱，用于評(píng)價(jià)細(xì)胞群體依賴(lài)性和增殖能力。由于細(xì)胞生物學(xué)性狀不同，細(xì)胞克隆形成率差別也很大，一般初代培養(yǎng)細(xì)胞克隆形成率弱，傳代細(xì)胞系強(qiáng)； 二倍體細(xì)胞克隆形成率弱，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系強(qiáng)；正常細(xì)胞克隆形成率弱，腫瘤細(xì)胞強(qiáng)?？寺⌒纬陕逝c接種密度有一定關(guān)系，做克隆形成率測(cè)定時(shí)，接種細(xì)胞一定要分散成單細(xì)胞懸液，直接接種在培養(yǎng)皿中，持續(xù)一周以上，隨時(shí)檢查，到細(xì)胞形成克隆時(shí)終止培養(yǎng)。
目的：通過(guò)目的基因過(guò)表達(dá)/干擾細(xì)胞組、空細(xì)胞組與陰性對(duì)照組(空病毒)克隆形成數(shù)量的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，研究基因?qū)?xì)胞群體依賴(lài)性和增殖能力的影響。
材料：病毒和細(xì)胞株
步驟：鋪板——細(xì)胞培養(yǎng)——觀(guān)察克隆，染色，計(jì)算克隆形成率